Tipos de microscópios de fluorescência

Quando microscópios foram inventados por volta de 1600 dC, os filósofos naturais voltaram os olhos para um mundo dentro de um mundo. Quando Antony van Leeuwenhoek trabalhada pequenas, lentes altamente curvadas e um suporte mecânico para ajustamento da vista, abriu uma janela para o mundo microscópica de bactérias, células de sangue, protozoários e a estrutura celular de plantas. Mas ao longo da história da microscopia, houve sempre uma pergunta: O que são essas coisas estranhas visto através de uma lente? microscopia de fluorescência refere-se a um conjunto de técnicas que minimizem essa incerteza - porque em microscopia de fluorescência quando a luz é brilhou sobre uma amostra, que brilha sua própria luz de volta.

epifluorescência

De longe, o microscópio de fluorescência mais comum é a configuração de epifluorescência. Num microscópio de epifluorescência, uma fonte de luz - tipicamente uma lâmpada de mercúrio ou xénon - brilha através de um filtro que seleciona uma zona estreita de comprimentos de onda. A luz filtrada brilha sobre a amostra através da lente objectiva de microscópio. A luz que entra é absorvida por fluororos - marcadores moleculares que emitem luz de um comprimento de onda longo quando absorvem luz de um comprimento de onda mais curto. Luz dos fluoróforos, juntamente com luz difusa da fonte de iluminação, volta para a lente objetiva e ao detector ou olho. Ao longo do caminho, outro filtro bloqueia a luz de iluminação, então tudo o que resta é a luz fluorescente da amostra.

confocal

Um microscópio de epifluorescência recolhe a luz de todos os lugares dentro do campo de visão do microscópio. Uma parte da luz de excitação é absorvida antes do plano focal do microscópio, alguns no plano focal e algum para além do plano focal. Porque o microscópio recolhe toda essa luz, a imagem irá conter uma imagem nítida de luz no foco, mas também terá a luz fora de foco de outras regiões. Um microscópio confocal fixa que, ao focar um ponto de laser no mesmo plano que o microscópio está focado. Em seguida, uma pinhole vai na frente do detector, onde bloqueia toda a luz que não vem do foco microscópio. Por digitalizar a amostra, pode ser obtida uma imagem tridimensional do objecto limpo.

multiphoton

Em um microscópio confocal o alinhamento é muito sensível. Se o ponto de laser, a objetiva do microscópio, a ótica de recolha ea pinhole estão fora até mesmo a menor quantidade que o desempenho microscópio sofre. Um microscópio multiphoton fica em torno esse problema usando um comprimento de onda de laser que é apenas metade tão enérgico como ele precisa ser para excitar os fluoróforos na amostra. A única maneira que os fluoróforos vai ficar animado e emite fluorescência é se a luz do laser é brilhante o suficiente para que duas partículas de luz - fótons - atacar o fluoróforo em um tempo muito curto. Isso só acontece quando o laser é focado para uma muito pequena local. Assim, o único lugar na amostra que emite luz é o lugar onde o laser é focalizada, o que mantém a imagem agradável e limpo, porque não há luz de fundo extra para se livrar de - o que significa que não há pinhole para alinhar.

Reflexão interna total de fluorescência (TIRF)

Outra maneira de obter imagens muito limpas é certificar-se a luz de excitação não ir muito longe na amostra. Se uma gota de neurónios, por exemplo, é colocada em uma gota de solução numa lâmina de vidro, em seguida, alguns dos neurónios irá aderir à superfície do vidro. Em um microscópio de fluorescência de reflexão total interna (TIRF), a luz é dirigida lateralmente para a lâmina de vidro de modo que ele não se tornam na solução mantendo as células. Mas um pouco da luz apenas mal vaza para a solução - apenas muito perto da superfície do vidro. Isto significa que os únicos lugares que emitem luz será numa região muito fina à direita contra a superfície do vidro. Para algo como neurônios, onde tanta coisa interessante acontece na superfície das células, esta técnica pode ser muito eficaz.

Super-Resolution

Todos os microscópios - incluindo microscópios de fluorescência - são limitados pelos física que governa a propagação da luz. Uma das regras básicas é que um ponto de luz focalizado só pode chegar tão pequeno - e não menor. Para a luz visível, que o tamanho é cerca de 200 nanômetros, ou 200 bilionésimos de metro. Mas moléculas individuais são apenas alguns nanômetros de tamanho, por isso há muitas características interessantes que estão abaixo desse limite de tamanho, o chamado limite de difração. Os cientistas estão desenvolvendo "super-resolução" técnicas para burlar esse limite. microscopia estruturado iluminação (SIM) e microscopia estimulada depleção de emissão (STED), por exemplo, são os dois métodos de microscopia de fluorescência, que limitam o tamanho da mancha de emissão de luz, reduzindo o tamanho da mancha de luz de excitação.

Referências

• ligação MicroscopeHelp.com: A História do Microscópio
• ligação Florida State University: técnicas especializadas Microscopia --- microscopia de fluorescência
• ligação Precision Aplicada: Super-Resolution Technology

Sobre o autor

Publicado pela primeira vez em 1998, Richard Gaughan contribuiu para publicações como "Photonics Spectra," "O cientista" e outras revistas. Ele é o autor de "Genius acidental: O grande por chance Descobrimentos Mundial." Gaughan é bacharel em Física pela Universidade de Chicago.